更清楚地看見生命分子的結(jié)構(gòu)，有助于我們了解分子的功能和各個組分之間的相互作用。圖源：EMBL。Credit: Agnieszka Obarska-Kosińska/EMBL and MPI of Biophysics
編者按： 2023年，F(xiàn)rontiers for Young Minds期刊網(wǎng)站再度邀請五位諾貝爾獎得主，專門為青少年撰寫關(guān)于他們的研究的科普文章?！顿愊壬帆@授權(quán)翻譯了這一系列文章。 了解生物的分子結(jié)構(gòu)，一方面有助于科學(xué)家更好地理解這些分子的生物學(xué)功能，另一方面也對藥物研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。 在下面這篇文章中，2017年諾貝爾化學(xué)獎得主理查德·亨德森與Frontiers for Young Minds雜志撰稿人諾亞·塞格夫，詳解冷凍電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展歷程，以及它如何引發(fā)生命分子結(jié)構(gòu)的分辨率革命。
諾亞·塞格夫 理查德·亨德森 ｜ 撰文
Ano-GPT ｜ 翻譯
瞿立建 ｜ 校譯
理查德·亨德森博士。他與雅克·杜博歇（Jacques Dubochet）教授和約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）教授因“開發(fā)冷凍電子顯微鏡，用于溶液中生物分子結(jié)構(gòu)的高分辨率測定”，獲得了2017年的諾貝爾化學(xué)獎。圖片：A. Mahmoud，來源：諾獎官網(wǎng)。本文基于塞格夫?qū)嗟律牟稍L撰寫而成。
結(jié)構(gòu)生物學(xué)是觀察構(gòu)成生命的各種分子的結(jié)構(gòu)，這些分子存在于人類和其他動物中，也存在于微生物和植物之中。為了解析這些結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)生物學(xué)家使用越來越精確的成像技術(shù)，從而“看見”或確定更小更多樣的分子的結(jié)構(gòu)。冷凍電子顯微鏡是一種非常先進和強大的成像技術(shù)：電子被發(fā)送到冷凍樣品中，以確定單個分子的結(jié)構(gòu)，其放大倍數(shù)足以看見原子。這些圖像使我們更深入地理解生命的基本結(jié)構(gòu)和功能。在本文中，我們將描述冷凍電子顯微鏡掀起的這場“分辨率革命”的發(fā)展過程。受訪者亨德森博士因為這方面的貢獻最終獲得2017年的諾貝爾化學(xué)獎。
眼見為實：看見微觀的生命分子
生物體包含許多重要的結(jié)構(gòu)，并進行著多種活動。在人體內(nèi)，我們有很多器官，它們由細胞構(gòu)成，而細胞內(nèi)又有很多細胞器和分子執(zhí)行維持生命所必需的功能，例如能量代謝、排出廢物、物質(zhì)運輸和抵抗有害因子等（圖1）。為了了解生物體的工作原理并最終造福人類，我們需要密切觀察這些微觀分子的結(jié)構(gòu)，以及這些結(jié)構(gòu)執(zhí)行的活動。結(jié)構(gòu)生物學(xué)的使命便是觀察這些生物組分的結(jié)構(gòu)。過去，科學(xué)家們會從生命體內(nèi)正在發(fā)生的特定活動著手，例如能量的代謝、轉(zhuǎn)換和存儲，再尋找參與其中的分子，通常是蛋白質(zhì)和酶，然后才能去解析這些分子的結(jié)構(gòu)。
圖 1：細胞內(nèi)部的藝術(shù)效果圖。您可以將細胞內(nèi)部想象成一個密集的游樂場，其中包含許多不同的分子和細胞器，每個分子和細胞器都執(zhí)行其獨特的功能。要了解生命的運作方式，我們需要了解這些生命分子的結(jié)構(gòu)和功能。
然而在2000年，這一從功能到結(jié)構(gòu)的研究思路發(fā)生了變化。因為這一年，通過人類基因組計劃，科學(xué)家首次整理出完整的人類遺傳信息的“指令集”（DNA堿基序列），這些遺傳信息，甚至有約80%是之前不知道的。從那時起，通過基因信息，科學(xué)家可以在不必事先了解其功能的情況下先確定相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)。這開辟了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的全新路徑。那么，科學(xué)家又是如何確定這些分子的結(jié)構(gòu)呢？答案是：電子！
電子和顯微鏡
電子是存在于原子中的微小帶電粒子，它的流動產(chǎn)生了電力。電子也是光和其他形式的電磁輻射——如X射線——的來源。你能相信嗎，直到1895年，人類才發(fā)現(xiàn)了電子。在那一年，電子首次被英國劍橋大學(xué)物理系的科學(xué)家約瑟夫·湯姆孫（J. J.Thomson）識別并命名。40年后的1935年，J. J.湯普森的兒子喬治·湯姆孫（G. P. Thomson）證明了電子作為一種粒子，也同時表現(xiàn)出波的性質(zhì)：它具有頻率和波長，就像其他波一樣。湯姆孫父子都獲得了諾貝爾獎：父親是因為電子作為粒子的發(fā)現(xiàn)，兒子是因為電子作為波的發(fā)現(xiàn)。
不久之后，科學(xué)家意識到，如果電子表現(xiàn)得像波一樣，從某種意義上說，它們一定也表現(xiàn)得像光一樣，因為光也是一種波。因此，科學(xué)家想到也許可以用電子照亮他們想要觀察的微小樣品，就像我們基于可見光用眼睛、相機或普通顯微鏡來觀察物體一樣，這就是電子顯微鏡的起源。電子的波長很短，大約是可見光波長的十萬分之一。而波長越小，樣品放大的倍數(shù)越大。這意味著用電子拍攝的照片能顯示出更多的細節(jié)，也就是說電子顯微鏡具有很高的分辨率。由于它的高分辨率，電子顯微鏡可以解析以前不可能看清楚的微小分子的結(jié)構(gòu)。
電子顯微鏡如何工作？
電子顯微鏡中裝有能夠發(fā)射高能電子束的裝置，能夠穿過待研究的樣品（如圖2A所示）。當電子穿過樣品時，它們與樣品中的原子相互作用而偏離原來的行進路徑——稱為衍射，偏離方式?jīng)Q定于樣品中原子排列的方式。因此，電子通過樣品時“拾取”了其結(jié)構(gòu)信息。電子隨后通過特別設(shè)計的電磁場進行聚焦，這種電磁場稱為電磁透鏡，類似于相機內(nèi)的鏡頭，然后被電子探測器記錄下來。在這個階段，科學(xué)家得到了從樣品中衍射的電子的圖像，然后將其轉(zhuǎn)換為樣品本身的圖像。這種轉(zhuǎn)換基于簡單的物理學(xué)，其描述了被測物體與所成圖像之間的關(guān)系。這一轉(zhuǎn)換取決于許多因素，包括電子的波長和所使用的透鏡，但這都由顯微鏡專家來處理。
圖 2：電子顯微鏡。(A) 在電子顯微鏡中，電子源釋放出一束熱的高能電子，穿過被置于真空環(huán)境的樣本。當電子與樣品相互作用時，它們會發(fā)生衍射（散射），隨后被特殊透鏡收集和聚焦，然后被電子檢測器檢測。(B) 劍橋大學(xué)的電子顯微鏡，它允許科學(xué)家對冷凍生物樣本進行成像。圖片來源：劍橋大學(xué)
電子顯微鏡的挑戰(zhàn)
盡管電子可以幫助我們獲得非凡的分子圖像，但仍需克服重大挑戰(zhàn)。首先，正如量子物理學(xué)告訴我們的那樣，單個電子的活動具有不確定性。當你問電子遇到特定分子時會發(fā)生什么時，他們不會給出明確的答案。相反，他們有一定的概率（可能性）參與每個可能的結(jié)果。在電子世界中，所有可能發(fā)生的事情都確實發(fā)生了，每個選項都有確定的概率。這意味著科學(xué)家必須從許多電子中收集答案，并開動頭腦，將這些信息組合起來。為實現(xiàn)這一目標，我們用數(shù)百萬個電子照射樣本，并使用它們的總體平均值來獲得合理的答案。
其次，電子的能量非常高，在成像過程中必須要穿過樣品，而這會對樣品造成損壞。這些超高能電子和任何其他類型的高能輻射一樣，可以將樣品分子中的電子打出來。這會改變樣品分子的形狀和特性，因為生物分子相對脆弱。因此，科學(xué)家很難在單個生物分子被破壞之前獲得足夠的結(jié)構(gòu)信息。應(yīng)對這一挑戰(zhàn)的一種方法是，拍攝許多獨立的、相同的分子的圖像：至少 500 個，并對圖像進行平均以獲得分子典型的結(jié)構(gòu)。另一種方法是以特殊方式冷卻樣品，使其更能抵抗電子損傷——這將在下一節(jié)中介紹。另一個挑戰(zhàn)在于，電子一旦靠近任何原子就會發(fā)生衍射。這意味著電子源和樣品之間必須暢通無阻，這樣電子才能到達目標分子，而不會因其他分子（如空氣中的氧氣和氮氣）擋道而散射。換句話說，科學(xué)家必須在電子顯微鏡的樣本周圍創(chuàng)造一個真空。然而由于生物分子總是處在含水溶液中（想一想血液中的分子），水分子難免會蒸發(fā)到真空之中，此外水分的蒸發(fā)還會使樣本過于干燥，這又通常會損壞樣本中的生物分子。面對這些問題，結(jié)構(gòu)生物學(xué)家發(fā)揮他們的創(chuàng)造力，利用水的獨特性質(zhì)來應(yīng)對這一挑戰(zhàn)。
水在極低溫度下能保持液態(tài)嗎？
為了解水的獨特性質(zhì)，您可以嘗試下面這個實驗（圖 3 ）。拿一個帶蓋的空罐子，裝滿水，在水下擰緊蓋子從而避免罐子里混入氣體，然后將其放置于冰箱的冷凍層。一天之后，罐子里的水溫將下降至? 10 °C 或? 20 °C（通常情況下水會在0 °C時結(jié)冰）。第二天，把罐子從冰箱里拿出來看看——水是變成了固態(tài)冰，還是保持液態(tài)？
圖 3：家里的過冷水。(1) 取一個空罐子，裝滿水，確保里面沒有氣泡。(2) 將罐子密封好 (3) 放入冰箱冷凍一天。(4) 然后，取出罐子。水是結(jié)冰的還是液態(tài)的？如果它仍然是液體，你就制得了過冷水！
大多數(shù)情況下，您會發(fā)現(xiàn)水仍然是液態(tài)，盡管它已經(jīng)冷卻到低于其冰點 (0 °C) 的溫度。在我們的實驗中，我們希望將水進一步冷卻到? 170 °C 以下，因為在這個溫度下它變得平靜又穩(wěn)定。我們還希望避免產(chǎn)生冰晶，因為它們會干擾我們的測量。為此，我們必須使用雅克·杜博歇 實驗室開發(fā)的特殊冷卻方法，他與我 (理查德·亨德森) 、約阿希姆·弗蘭克于2017 年共同獲得了諾貝爾化學(xué)獎。在這種方法中，我們要用到非常冷的液體乙烷或丙烷（天然氣中的成分，組成原子只有碳和氫），將乙烷/丙烷液體冷卻至? 185 °C，然后我們將一層非常薄的水膜浸入其中，這層水膜在極端時間內(nèi)——約千分之一秒——迅速冷卻，以至于沒有時間形成有組織的冰晶，而是保持無序的液態(tài)形式 [1]，我們稱之為無定形冰。這樣，我們就得到了過冷水。
熱電子和冷樣品的神奇組合
事實證明，過冷水的薄膜非常適合我們想要用電子顯微鏡成像的生物分子懸浮在其中。當我們將這個冷卻步驟添加到成像過程中時，就是所謂的冷凍電子顯微鏡技術(shù)。
冷凍電子顯微鏡技術(shù)使我們能夠應(yīng)對前文提到的兩個挑戰(zhàn)：一方面它使標本穩(wěn)定，從而更能抵抗高能電子的破壞，另外，它允許生物分子處于自然的水環(huán)境中，避免水蒸發(fā)到真空之中。它還有一個更重要的優(yōu)勢：與大多數(shù)其他液體不同，水在冷卻到 4 °C 以下時會膨脹，這一特性有助于生物分子在過冷水中保持完好。想象一下，如果水在冷卻時收縮，它就會擠壓甚至破壞要成像的分子。這種相當簡單但高效的冷凍電子顯微鏡成像方法使我們大大提高了生物分子成像的分辨率。這就是它有時被稱為“分辨率革命”的原因。
圖 4：冷凍電子顯微鏡拍出的圖像。(A) 一種稱為腺病毒的致病病毒的結(jié)構(gòu)。該圖像顯示了稱為衣殼的外表面，它是包裹病毒遺傳物質(zhì)的蛋白質(zhì)外殼。顏色代表距球體中心的距離：紅色距離中心最遠，藍色距離最近。(B) 一種參與微生物能量產(chǎn)生的酶。顏色代表酶的各個次級結(jié)構(gòu)單元（片段）。(C) 2013 年（左，淺紫色）和 2017 年（右，深紫色）冷凍電子顯微鏡的分辨率對比。圖片來源：(A) 改編自參考文獻 [2]；(B) 改編自參考文獻 [3]；(C) Martin H? gbom ，斯德哥爾摩大學(xué)，基于 V. Falconieri 的圖像。
冷凍電子顯微鏡的未來
電子是對生物分子成像的最佳粒子。為了讓您了解它們有多好，我們把它們與另外兩種常用粒子進行比較：X 射線光子（類似于光子，但波長較短）和中子（一種來自原子核的粒子）。我們可以計算出成像時所獲得的結(jié)構(gòu)信息量與該粒子在樣本中造成的損害的比值，以此來衡量該粒子的成像效果。根據(jù)該標準，電子比 X 射線好 1000 倍，比中子好3倍！這就是我和我的同事多年前開始使用電子而不是其他粒子的原因。如今，冷凍電子顯微鏡已經(jīng)獲得非常成功的應(yīng)用，使用它的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家的數(shù)量已經(jīng)很多了，但還在迅速增加。冷凍電子顯微鏡仍有很大的改進空間。一是改進電子探測器，它們?nèi)匀徊粔虼蠡蛐什粔蚋撸刮覀儗嶋H所用的電子比理論上應(yīng)使用的電子要多得多。此外，當電子束接觸樣品時（包括水分子和生物分子），如果能進一步減少樣品的運動將會改善成像效果[4, 5] 。我們相信，在大約 5 年的時間里，應(yīng)對這些挑戰(zhàn)將會取得重大進展。屆時我們將擁有更強大的工具，讓我們更好地理解許多生物學(xué)問題，例如生命如何運作以及如何繁殖。我們獲得的信息可能有助于我們維護人、動物和植物的健康。我們可以期待冷凍電子顯微鏡的光明前景！SAIXIANSHENG給年輕人的建議
我，理查德，想分享一些我在整個職業(yè)生涯中遵循的實用建議。這些建議來自1960 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主彼得·梅達沃 (Peter Medawar) 的著作。獲得諾貝爾獎后，彼得·梅達沃出版了《可解的藝術(shù)》（The Art of the Soluble）和《寄語青年科學(xué)工作者》(Advice to a Young Scientist)兩本書。他在書中說，科學(xué)和生活中有很多有趣的東西，我們應(yīng)該對一切事物保持好奇。但我們也應(yīng)該選擇一些我們特別感興趣的東西來做。此外，他說科學(xué)家們應(yīng)該致力于當前可以被回答的科學(xué)問題，而不是 100 年后才能被解決的那一類遙遠的問題，因為那已經(jīng)超出了科學(xué)家的一生。他認為科學(xué)是可解決的藝術(shù)，得專注于可以解決的問題?？茖W(xué)家應(yīng)該基于現(xiàn)在的技術(shù)回答當前可以被回答的問題。
我讀大學(xué)的時候?qū)W的是物理，當時，我想知道物理學(xué)會走向何方，我記得我列了一個清單，列出了關(guān)于未來所有有趣的話題。有聚變研究，涉及從氫聚變中產(chǎn)生無限的能量。然后是高能粒子物理學(xué)，這一領(lǐng)域的研究促成了新粒子的發(fā)現(xiàn)，包括希格斯玻色子等。還有固體物理學(xué)，它推動了計算機工業(yè)和微芯片的發(fā)展。生物物理學(xué)、天體物理學(xué)、宇宙學(xué)、黑洞和中子星等都是其他有趣的話題。如果我選擇其中的任何一個主題來研究，它們都會同樣有意思、令人興奮。所以，如果你決定從事科學(xué)，你必須選擇你感興趣的東西，這樣你的研究和工作就是自發(fā)的，而不是因為受到任何人的強迫。當你有興趣和上進心時，遇到困難也不太會困擾你——你只會把它當作一個挑戰(zhàn)并繼續(xù)前進。一旦你選擇了一個有趣的主題，在你真正朝著那個方向前進之前，最好盡可能多地了解你為研究這個主題可以進行的各種活動。如果經(jīng)過 6 個月或一年的努力，結(jié)果證明你的想法不是很好，請不要猶豫重新思考并尋找新的方向。與過去相比，今天的科學(xué)發(fā)展非常迅速。僅在 100 年前，我們甚至不知道 X 射線和電子的存在，而現(xiàn)在我們掌握了整個人類基因組的信息，我們擁有處理 DNA 的復(fù)雜方法，并且我們幾乎可以弄清楚我們想要的任何東西。未來 100 年將是活著的好時機——也是成為科學(xué)家的好時機。享受你的生活，把自己投資在你最感興趣的事情上！
作者致謝：感謝 Alex Bernstein 提供插圖、Susan Debad 對手稿的編輯。封面圖來源：英國醫(yī)學(xué)研究理事會（MRC）分子生物學(xué)實驗室 via PNAS.
少年審稿人
霍莉，年齡：15歲
我是一名有抱負的生物醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生，熱愛所有與人體有關(guān)的事物。我喜歡看用科學(xué)來解開謎團的犯罪節(jié)目。我一直都醉心于醫(yī)學(xué)和相關(guān)研究。當我不學(xué)習(xí)時，我演奏音樂、跳舞和創(chuàng)作藝術(shù)。
Laurus國際科學(xué)學(xué)校，7年級，年齡：11 – 12歲
我們是東京Laurus國際科學(xué)學(xué)校7年級的學(xué)生！我們對任何科學(xué)感興趣！我們也喜歡玩 堡壘之夜（Fortnite）游戲 和國際象棋。
作者簡介
諾亞·塞格夫
諾亞·塞格夫（Noa Segev）是 Frontiers for Young Minds 的科學(xué)作家和項目協(xié)調(diào)員。她擁有理學(xué)學(xué)士學(xué)位、耶路撒冷希伯來大學(xué)物理學(xué)博士學(xué)位和以色列理工學(xué)院可再生能源工程碩士學(xué)位。自 2019 年以來，她一直在采訪諾貝爾獎獲得者，并與諾貝爾獎獲得者共同為 Frontiers for Young Minds諾貝爾獎合集撰寫文章。諾亞希望讓所有人都能了解諾貝爾獎獲獎發(fā)現(xiàn)背后的科學(xué)，并分享來自諾貝爾獎獲得者廣泛的專業(yè)和個人經(jīng)驗的寶貴見解。郵箱：noasegev@gmail.com
理查德·亨德森
理查德·亨德森 (Richard Henderson) 博士是蘇格蘭生物物理學(xué)家和分子生物學(xué)家，在英國劍橋大學(xué) MRC 分子生物學(xué)實驗室擔(dān)任研究科學(xué)家。他在在愛丁堡大學(xué)（蘇格蘭）獲得物理學(xué)學(xué)士學(xué)位，在劍橋大學(xué)（英格蘭）獲得分子生物學(xué)博士學(xué)位，博士期間研究課題是消化酶的結(jié)構(gòu)。
亨德森博士隨后在耶魯大學(xué)（美國康涅狄格州）從事博士后研究。1973 年，他以獨立研究科學(xué)家的身份返回劍橋 MRC 分子生物學(xué)實驗室，并工作至今。多年來，亨德森博士致力于改進電子顯微鏡，提高其分辨率，并使其適用于對精細的生物標本進行成像。這是一項重大的技術(shù)進步，使更廣泛的生物樣本進行成像，進而促進分子生物學(xué)的發(fā)展。由于這一成就，亨德森博士分享了 2017 年的諾貝爾化學(xué)獎。除了諾貝爾獎，亨德森博士還獲得了眾多其他著名獎項，包括羅森斯蒂爾基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究杰出工作獎（1991 年）和科普利獎英國皇家學(xué)會獎?wù)拢?016 年）。郵箱：rh15@mrc-lmb.cam.ac.uk
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