雙光子顯微鏡是對深層散射組織進行活體觀測不可或缺的儀器，以其遠超單光子顯微成像的穿透深度而受到生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的廣泛關(guān)注。
然而，傳統(tǒng)雙光子顯微成像的點掃描成像模式從根本上限制了其成像通量與三維感知速度，極易受復(fù)雜活體成像環(huán)境干擾，同時激發(fā)點巨大的瞬時光強會對活體生物樣本造成持續(xù)性的非線性光損傷，導(dǎo)致高速三維成像時長嚴重受限，極大地制約了病理學(xué)、免疫學(xué)和腦科學(xué)的發(fā)展。
2023年5月12日，清華大學(xué)戴瓊海、吳嘉敏、祁海作為共同通訊作者在 Cell 期刊發(fā)表了題為：Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue 的研究論文。
該研究首次提出了基于空間約束的多角度衍射編碼，實現(xiàn)非相干光孔徑合成；建立了雙光子合成孔徑顯微術(shù)（Two-photon synthetic aperture microscopy，2pSAM），“化點為針”，通過多角度針狀光束的掃描在實現(xiàn)高速三維感知的同時，將雙光子成像光毒性降低了1000倍以上；融合了戴瓊海院士團隊2021年同樣在 Cell 上所提出的數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)架構(gòu)，具備高速多區(qū)域像差矯正能力，即使在惡劣復(fù)雜活體環(huán)境下依然保持近衍射極限的空間分辨率，并進一步提升了傳統(tǒng)雙光子成像的穿透深度。
基于此，2pSAM能夠在哺乳動物深層散射組織中非侵入式地觀測大范圍亞細胞級動態(tài)變化，將毫秒級三維連續(xù)觀測時長從數(shù)分鐘提高到數(shù)十小時，為系統(tǒng)性地研究大規(guī)模細胞在不同生理與病理狀態(tài)下的交互作用打開了大門。交叉研究團隊利用2pSAM在小鼠活體觀測到了一系列新現(xiàn)象，包括急性腦損傷后腦組織內(nèi)周的多細胞互作，神經(jīng)元在超長時程連續(xù)觀測下展現(xiàn)出對視覺刺激的表征穩(wěn)定性與功能多樣性，以及首次完整高速記錄下了小鼠免疫反應(yīng)過程中淋巴結(jié)生發(fā)中心的形成過程，為病理學(xué)、腦科學(xué)和免疫學(xué)的研究打開了新窗口。
傳統(tǒng)雙光子顯微鏡使用“點掃描”的方案對三維樣本進行掃描，類似于共聚焦熒光顯微鏡，由于雙光子成像的非線性效應(yīng)使其能夠獲得數(shù)倍于單光子成像的穿透深度。例如，雙光子顯微鏡在小鼠大腦皮層的最大穿透深度可以達到1 mm。然而，這種點掃描方式嚴重限制了雙光子顯微鏡的三維成像速度與數(shù)據(jù)通量，并且由于在聚焦點位置極大的瞬時光強帶來了非常嚴重的非線性光損傷隱患。
2pSAM采用了軸向景深拓展的“針掃描”方案，通過改變針狀光束的不同傾角實現(xiàn)樣本三維信息的多角度投影，類似CT一樣實現(xiàn)快速三維成像；同時，受到雷達成像中合成孔徑方法的啟發(fā)，通過在像面處引入針孔所帶來的空間衍射編碼約束，實現(xiàn)了非相干光的孔徑合成，將多角度信息融合為大數(shù)值孔徑對應(yīng)的高空間分辨率；進一步利用樣本的時空連續(xù)性先驗，有效避免了視角掃描帶來的時間分辨率損失。這樣一種全新的計算雙光子成像架構(gòu)，在保留雙光子本身深層組織穿透能力的同時，將有效成像通量提升了三個數(shù)量級以上。
圖1. 雙光子合成孔徑顯微術(shù)（2pSAM）系統(tǒng)圖
除此之外，樣本引起的光學(xué)像差給顯微成像帶來的分辨率與信噪比損失十分嚴重，隨著成像深度的增加這種降質(zhì)尤為明顯。目前雙光子成像中的硬件自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)主要面臨著以下一些問題：
1、成像系統(tǒng)復(fù)雜、成本高昂；
2、有效校正視場有限，大視場多區(qū)域校正速度緩慢。
2pSAM通過激發(fā)光編碼獲得了超精細的四維空間角度光場數(shù)據(jù)，能夠使用數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)架構(gòu)（DAO），無需在光學(xué)系統(tǒng)中增加額外的波前傳感器或者空間調(diào)制器，就能實現(xiàn)信號采集與自適應(yīng)像差校正的解耦，在后處理端完成大范圍多區(qū)域自適應(yīng)光學(xué)，顯著提升在復(fù)雜成像環(huán)境中的空間分辨率與信噪比。
圖2. 雙光子合成孔徑顯微術(shù)（2pSAM）結(jié)合數(shù)字自適應(yīng)光學(xué)（DAO）與傳統(tǒng)雙光子顯微鏡（TPM）面對復(fù)雜成像條件下的結(jié)果對比。從左至右依次為：正常條件下拍攝，物鏡校正環(huán)不匹配情況下拍攝，物鏡為水鏡且缺乏浸潤水的情況下拍攝，物鏡與樣本之間增加散射膠帶后進行拍攝
長時間的激光照射會對活體樣本產(chǎn)生嚴重的光毒性。研究團隊發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)雙光子顯微成像由于使用飛秒激光激發(fā)與高NA會聚，在樣本局部會產(chǎn)生巨大的瞬時光強，由此所產(chǎn)生的非線性光毒性在以往被極大地低估了，而一旦在長時程成像過程中，就會不斷積累損傷從而影響細胞正常狀態(tài)。與之對比，2pSAM化點為針，通過軸向景深拓展，在保持同樣熒光激發(fā)效率的前提下，將瞬時峰值功率降低了1000倍，從而有效解決了非線性光損傷的問題。一方面能顯著減少熒光探針的光漂白，對于同一類易淬滅染料，在同樣激發(fā)光強下，傳統(tǒng)雙光子僅能拍攝幾十個三維體，而2pSAM能夠連續(xù)拍攝幾十萬個三維體而沒有明顯的信號衰減。
除此之外，團隊還對小鼠腦皮層中的小膠質(zhì)細胞與腦損傷過程中的中性粒細胞進行了連續(xù)成像測試，發(fā)現(xiàn)即使使用較弱的光強，傳統(tǒng)雙光子顯微成像在連續(xù)拍攝半小時以上時仍會導(dǎo)致大量細胞凋亡，而在2pSAM成像過程中細胞保持了正常的表型，并且相比于對照組結(jié)果無明顯差異。
團隊通過一系列在體與離體實驗充分證明了2pSAM能夠?qū)鹘y(tǒng)雙光子成像的光毒性下降三個數(shù)量級以上，為長時程高速活體組織成像打開了新窗口。
生發(fā)中心（Germinal center，GC）是次級淋巴器官中的動態(tài)組織區(qū)域，是被抗原激活后的B細胞在趨化作用引導(dǎo)下聚集形成的結(jié)構(gòu)，也是產(chǎn)生高親和力抗體及形成長期免疫記憶關(guān)鍵場所。但是由于GC形成的隨機性和免疫細胞本身對光損傷的敏感性，完整的GC形成過程從未被高速長時間的清晰記錄過。借助2pSAM，得以首次完整清晰地觀測到了免疫反應(yīng)下GC形成的全部過程。
研究人員將帶有熒光標記的抗原特異性B細胞回輸?shù)叫∈篌w內(nèi)，隨后將抗原接種到腹股溝附近以誘導(dǎo)引流淋巴結(jié)中生發(fā)中心的形成，并于免疫后90到110個小時內(nèi)（生發(fā)中心未形成期），在大視場下持續(xù)地對淋巴結(jié)中抗原特異性B細胞的動態(tài)行為進行追蹤，成功揭示了GC形成過程中B細胞的分裂增殖是GC形成的主因，輔助以周圍活化B細胞的聚集。由于拍攝時長達十余小時，淋巴結(jié)本身會產(chǎn)生劇烈的形變，2pSAM通過多視角信息能夠進行實時軸向聚焦位置反饋，實現(xiàn)自動對焦，有效避免了長時程拍攝過程中的樣本漂移。
研究人員進一步借助2pSAM在患有創(chuàng)傷性大腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）的小鼠和正在接受視覺條紋刺激的GCaMP轉(zhuǎn)基因小鼠進行腦皮層組織的細胞動態(tài)觀測。在TBI小鼠受傷區(qū)域磨薄顱骨后觀測到了外周免疫細胞中性粒細胞在浸潤后與內(nèi)周星形膠質(zhì)細胞的相互作用，如通過直接接觸定向產(chǎn)生遷移體（migrasome）來傳遞物質(zhì)和信息。對GCaMP轉(zhuǎn)基因小鼠開顱恢復(fù)2周后進行視覺上的條紋刺激，進一步證實了長達數(shù)小時內(nèi)小鼠視覺皮層神經(jīng)元鈣信號對不同方向條紋選擇性表達的持續(xù)性和穩(wěn)定性，同時也通過長時程功能數(shù)據(jù)挖掘出了多種單細胞水平的神經(jīng)響應(yīng)類型，體現(xiàn)了神經(jīng)元的功能多樣性。這些現(xiàn)象對于傳統(tǒng)雙光子顯微鏡而言都極具挑戰(zhàn)，特別是會由于光毒性本身導(dǎo)致會導(dǎo)致細胞異常表現(xiàn)，比如會導(dǎo)致神經(jīng)元在長時程拍攝過程中響應(yīng)強度不斷下降。
清華大學(xué)自動化系博士生趙志鋒、周逸亮、醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系博士后劉波、自動化系博士后賀敬為該論文的共同第一作者，清華大學(xué)自動化系、腦與認知科學(xué)研究院、清華-IDG/麥戈文腦科學(xué)研究院戴瓊海教授，吳嘉敏助理教授，醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系祁海教授為論文共同通訊作者，趙家胤、蔡燁怡、范靜濤、李欣陽、王紫霖、盧志參與并做出重要貢獻。該工作得到了國家自然科學(xué)基金委的大力支持。
論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.04.016
