單分子定位顯微鏡（Single molecule localization microscopy，SMLM）通過(guò)結(jié)合光控?zé)晒夥肿訕?biāo)記、質(zhì)心擬合算法、單分子檢測(cè)等技術(shù)，將熒光顯微鏡的分辨率提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞納米結(jié)構(gòu)的解析，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)的觀察研究中。但其在多色成像的拓展應(yīng)用一直受到限制，主要原因是目前性能優(yōu)異的光控?zé)晒夥肿犹结?如Alexa Fluor 647, CF660C等)大都集中在遠(yuǎn)紅波段，很難采用常規(guī)的基于帶通濾光片選擇的辦法來(lái)實(shí)現(xiàn)多通道成像。
近日，中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所徐濤院士課題組與紀(jì)偉研究員課題組在Light: Science & Applications雜志發(fā)表了題為“ Tetra-color superresolution microscopy based on excitation spectral demixing”的研究論文，提出了一種基于激發(fā)譜拆分的多色超分辨成像技術(shù)（Excitation-resolved stochastic optical reconstruction microscopy, ExR-STORM），該技術(shù)通過(guò)激發(fā)效率差異來(lái)識(shí)別不同的遠(yuǎn)紅熒光探針，實(shí)現(xiàn)了四色單分子定位超分辨成像。
徐濤院士、紀(jì)偉研究員和谷陸生正高級(jí)工程師為該論文的共同通訊作者，吳琬琰博士、博士生羅世行和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的樊春燕助理研究員為共同第一作者。胡俊杰研究員和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所的孟文翔研究員為該文的細(xì)胞生物學(xué)成像驗(yàn)證提供了建設(shè)性意見(jiàn)。該工作受到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)（B類(lèi)）"生物大分子復(fù)合體結(jié)構(gòu)與功能的跨尺度研究"等資助。
ExR-STORM顯微鏡提供了一種單分子識(shí)別新方法，并進(jìn)一步提高了單分子光譜拆分能力。該技術(shù)通過(guò)使用620 nm，639 nm和671 nm三個(gè)波長(zhǎng)激光激發(fā)遠(yuǎn)紅熒光探針，把激發(fā)光譜的特征作為單分子的“指紋”，以實(shí)現(xiàn)多色成像。
該方法的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新是設(shè)計(jì)了高頻振鏡分時(shí)同步快速成像光路，可以消除單分子閃爍導(dǎo)致的強(qiáng)度變化影響（圖1）。
圖1. ExR-STORM工作原理，利用振鏡將三個(gè)激光器激發(fā)下的圖像投影到相機(jī)不同區(qū)域，實(shí)現(xiàn)高頻分時(shí)同步快速成像。
這個(gè)設(shè)計(jì)也為單分子激發(fā)譜的測(cè)量提供了新的思路。使用ExR-STORM顯微鏡結(jié)合四種遠(yuǎn)紅探針的標(biāo)記，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體、中間絲、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管等結(jié)構(gòu)的四色超分辨成像（圖2）。
圖2. 用CF660C, Alexa Fluor 647, Dyomics 654 和DyLight 633標(biāo)記線粒體、中間絲、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微管，實(shí)現(xiàn)四色單分子定位超分辨成像。
成像結(jié)果表明該技術(shù)具有光譜拆分能力強(qiáng)、色差導(dǎo)致的定位誤差小等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞器互作、生物大分子共定位分析等生物研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。同時(shí)該技術(shù)的樣品制備方法及成像流程與常規(guī)STORM技術(shù)兼容，使該技術(shù)同時(shí)具備高性能以及易用性，有利于該技術(shù)的推廣及應(yīng)用，為生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究提供了有力的成像工具。
