冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)顯示了嵌入在玻璃化薄冰中的大分子的原子結(jié)構(gòu)，它們接近于原生狀態(tài)。然而，作為確保高圖像質(zhì)量的關(guān)鍵因素，冰厚的均勻性在樣品制備過程中控制得很差，這已成為高分辨率冷凍電鏡的主要挑戰(zhàn)之一。
2022年12月15日，北京大學(xué)彭海琳，韋小丁，清華大學(xué)王宏偉及劉楠共同通訊在Nature Methods 在線發(fā)表題為“Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)薄冰的均勻性依賴于支撐膜的表面平整度，并開發(fā)了一種使用超厚石墨烯(UFG)作為支撐進(jìn)行冷凍電鏡標(biāo)本制備的方法，以實(shí)現(xiàn)更好地控制玻璃冰厚度。
該研究發(fā)現(xiàn)UFG上均勻的薄冰提高了玻璃化標(biāo)本的圖像質(zhì)量。利用這種方法，該研究成功地測定了血紅蛋白(64 kDa)、不對稱的α胎蛋白(67 kDa)和鏈霉親和素(52 kDa)的三維結(jié)構(gòu)，分辨率分別為3.5 ?、2.6 ?和2.2 ?。此外，該研究結(jié)果證明了UFG在冷凍電子斷層掃描和基于結(jié)構(gòu)的藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的潛力。
冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)已成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的主要工具。隨著冷凍電子顯微鏡分辨率的提高，生產(chǎn)高分辨率結(jié)構(gòu)測定所需的均勻薄冰變得越來越重要。對于分子量小于100 kDa的小生物分子，冷凍電子顯微鏡的低對比度阻礙了成功的重建，并降低了能夠?qū)崿F(xiàn)的分辨率，因?yàn)楦叻直媛实慕Y(jié)構(gòu)確定需要薄冰來最小化背景噪聲。
在冷凍電鏡樣品制備中制備薄冰的標(biāo)準(zhǔn)過程中，通常通過從支撐膜中抽干多余的溶液來獲得薄液體膜。最近發(fā)現(xiàn)，抽干過程中液固界面的粗糙和不均勻是生產(chǎn)可重復(fù)和均勻冰厚的基本限制。1990年，人們發(fā)現(xiàn)薄膜的均勻性和厚度顯著地受到下方支撐的粗糙度的影響。即液膜越薄，支撐粗糙度的作用越明顯。因此，均勻薄的玻璃冰的生產(chǎn)似乎依賴于超厚支撐膜的發(fā)展。
據(jù)研究人員所知，支撐膜的表面平整度與冰厚均勻性之間的關(guān)系還不甚清楚，用于薄冰沉積的超厚支撐膜還沒有被創(chuàng)造出來。即使在薄的氧化石墨烯納米片和生長在銅箔上的石墨烯薄膜上，密集的靜態(tài)皺紋(褶皺和波紋)也是不可避免的，盡管這兩者已被證明有助于更好的冷凍電鏡樣品制備。褶皺表面的高度差可達(dá)數(shù)十納米，并將直接塑造冰的形狀，導(dǎo)致冰的厚度不均勻，數(shù)據(jù)收集區(qū)域的顆粒高度分布也不盡相同。此外，皺面在高傾斜角度下會產(chǎn)生明顯的強(qiáng)噪聲，成為應(yīng)用于冷凍電子斷層掃描(cryo-ET)時的一個嚴(yán)重問題。
石墨烯粗糙度決定了冰厚的均勻性（圖源自Nature Methods ）
該研究提出了一種無褶皺的預(yù)拉伸超厚石墨烯(UFG)，用于均勻薄冰制備，其中目標(biāo)顆粒被吸附在UFG表面的同一平面上，這將它們與空氣-水界面隔離。在UFG制備的樣品的+60°至- 60°傾斜過程中，該研究沒有觀察到通常在傳統(tǒng)粗糙石墨烯膜中出現(xiàn)的任何波紋特征。使用UFG，該研究獲得了血紅蛋白(64 kDa)在3.5 ?分辨率的重建，α胎蛋白(67 kDa)在2.6 ?分辨率的重建，鏈菌親和素(52 kDa)在2.2 ?分辨率的重建，這使得在原子級分辨率的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)可視化。
此外，UFG可以與功能配體提供平坦均勻的相互作用表面，從而實(shí)現(xiàn)更可控的生物活性功能化，以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)生物分子的高親和力和生物友好性識別。除了在原子分辨率EM成像中的應(yīng)用外，UFG的設(shè)計(jì)還可以推廣到其他二維材料，進(jìn)一步擴(kuò)展到藥物發(fā)現(xiàn)、高性能電子器件和分離膜的應(yīng)用。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01693-y
