核酸檢測逐漸成為病原體診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，隨著新型冠狀病毒疫情的持續(xù)蔓延，核酸檢測的重要性正不斷被大眾認(rèn)知和認(rèn)可。作為高靈敏度、絕對定量、高耐受性的新一代核酸檢測技術(shù)，數(shù)字化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（數(shù)字PCR，dPCR），在稀有突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、液體活檢、單細(xì)胞分析、轉(zhuǎn)基因檢測、病毒載量檢測、微生物定量分析、NGS文庫制備等應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。
蘇州醫(yī)工所周連群課題組聚焦生物傳感器領(lǐng)域，深耕十余年，在生物傳感方法開發(fā)、生物芯片設(shè)計(jì)加工、生命科學(xué)儀器研制等方面積累了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在數(shù)字PCR研發(fā)方面，基于隔離穩(wěn)定性高、溫度均勻性好、檢測速度快的芯片式數(shù)字PCR（cdPCR）方法，自主研發(fā)了高通量數(shù)字化芯片及高通量數(shù)字化核酸分析儀，圍繞高通量數(shù)字化核酸檢測方法、芯片、試劑和儀器等方面取得了一系列重要進(jìn)展。
在高通量數(shù)字化芯片的加工與改性方面，周連群課題組的李金澤、邱亞軍等人在Analyst上發(fā)表題為Heterogeneous modification of through-hole microwell chips for ultralow cross-contamination digital polymerase chain reaction的論文，提出了針對數(shù)字化芯片三維異質(zhì)性改性的新策略，通過內(nèi)壁親水、表面疏水的異質(zhì)性化學(xué)改性，實(shí)現(xiàn)了高填孔率、低殘留的數(shù)字化樣品分割。通過深硅刻蝕可以得到高密度蜂窩狀微孔陣列，如何保證待測生物樣本能高效的填充入微孔，并且降低液體在表面殘留導(dǎo)致的孔間連通，是數(shù)字化樣品分割的關(guān)鍵。
針對該問題科研人員提出了對于均質(zhì)硅材料的三維異質(zhì)性改性策略，即通過微接觸印刷只在特定的空間位置發(fā)生化學(xué)修飾，進(jìn)而在均質(zhì)材料的三維空間上形成具有不同化學(xué)性質(zhì)的界面。通過工藝優(yōu)化消除了樣本揮發(fā)導(dǎo)致的擴(kuò)散效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了芯片表面的選擇性疏水修飾。三維異質(zhì)性改性后的芯片可以達(dá)到91%以上的填孔率以及小于5%的液體殘留率，優(yōu)于商業(yè)化的數(shù)字PCR芯片。利用該芯片可以實(shí)現(xiàn)高效準(zhǔn)確的dPCR檢測，定量結(jié)果的線性相關(guān)性達(dá)到0.999以上。該核心技術(shù)的突破為自研cdPCR的精準(zhǔn)定量奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
圖1 高通量數(shù)字化核酸檢測芯片的三維異質(zhì)性改性效果圖
在樣本的數(shù)字化分配與封裝方面，周連群課題組的高旭等人在Biomicrofluidics上發(fā)表題為High filling rate digital PCR through-hole array chip with double independent S-shaped flow channels的論文，提出了針對數(shù)字化芯片的微流控進(jìn)樣封裝方法，通過雙S型流道夾心數(shù)字化芯片的結(jié)構(gòu)，有效提高的樣品的填孔率和裝載重復(fù)性。傳統(tǒng)的刷樣方式，受限于操作的繁瑣性，存在耗時長、重復(fù)性差、易污染的問題，限制了芯片式數(shù)字PCR的應(yīng)用。通過微流控結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化儀器設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣封裝的標(biāo)準(zhǔn)化和自動化，簡化用戶的手動操作步驟和整體樣品裝載和封裝時間。本文主要通過流體力學(xué)仿真結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證，解決了流體樣本與微孔相互作用過程中的穩(wěn)定性、均勻性和重復(fù)性問題，通過合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和優(yōu)化的進(jìn)樣條件，實(shí)現(xiàn)了填孔率大于99%、填孔液體體積CV達(dá)6%的高效、高均勻性進(jìn)樣與封裝。該成果的突破有效提升了自研cdPCR的易用性，為產(chǎn)品的臨床應(yīng)用推廣奠定了良好基礎(chǔ)。
圖2 數(shù)字化芯片的微流控進(jìn)樣封裝結(jié)構(gòu)：（a）結(jié)構(gòu)裝配圖；（b）結(jié)構(gòu)爆炸圖
在芯片式數(shù)字化核酸檢測的應(yīng)用方面，周連群課題組與華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科關(guān)明課題組合作在Sensors & Actuators: B. Chemical（中科院I區(qū)）上聯(lián)合發(fā)表題為Establishment of scalable nanoliter digital LAMP technology for the quantitative detection of multiple myeloproliferative neoplasm molecular markers的論文，對骨髓增殖性腫瘤（MPN）的多重標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)了超敏、多靶標(biāo)、定量檢測，從而為這種罕見病的早期診斷和靶向治療提供新的方法。Ph染色體（費(fèi)城染色體）陰性的經(jīng)典骨髓增殖性腫瘤是以一系或多系分化相對成熟的骨髓造血干細(xì)胞持續(xù)克隆性增殖為特征的惡性血液疾病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的分子標(biāo)志物被不斷發(fā)現(xiàn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）最新的骨髓增殖性腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，JAK2、MPL 和CALR三個基因的突變已被作為骨髓增殖性腫瘤診斷的重要參考指標(biāo)。
周連群研究員課題組與關(guān)明教授課題組“醫(yī)-工”結(jié)合，將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)快速等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)勢、微流控技術(shù)高通量的優(yōu)勢和數(shù)字PCR技術(shù)準(zhǔn)確定量的優(yōu)勢進(jìn)行整合，成功開發(fā)了一款數(shù)字LAMP檢測平臺，并基于納米粒子的特殊功能，對現(xiàn)有的LAMP檢測體系進(jìn)行了改良，可在60分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)骨髓增殖性腫瘤CALR-1、CALR-2和JAK2 V617F分子標(biāo)志物的準(zhǔn)確定量檢測，檢測靈敏度分別為0.5%、0.1%和0.5%突變水平。與現(xiàn)有的商業(yè)化數(shù)字PCR平臺相比，本項(xiàng)目開發(fā)的數(shù)字LAMP平臺具有檢測成本低、檢測速度快等優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景。論文的第一作者為曹國君博士和李金澤博士。
圖3 多靶標(biāo)數(shù)字LAMP檢測平臺檢測流程示意圖
芯片式數(shù)字PCR的研發(fā)工作得到了國家自然科學(xué)基金委、中國科學(xué)院項(xiàng)目的支持，形成了高耐受高擴(kuò)增效率試劑（CN201811098669.3）、三維異質(zhì)性改性（CN201810568211.3）、進(jìn)樣封裝一體化（CN201910377557.X）、物理分區(qū)式多靶標(biāo)檢測（CN201710560138.0）、均勻快速熱循環(huán)（CN201910911821.3）、高分辨率多色熒光成像（CN201910049908.4）、自適應(yīng)圖像處理算法（CN201910600118.0）等一系列核心技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了方法、芯片、試劑和儀器的全鏈條自主知識產(chǎn)權(quán)創(chuàng)新。相關(guān)儀器入選《中國科學(xué)院自主研制科學(xué)儀器2021》目錄，并完成了二類醫(yī)療器械的型式檢驗(yàn)，進(jìn)入醫(yī)療器械注冊證申報(bào)流程；已經(jīng)在華山醫(yī)院、北京基因組所等多家醫(yī)院、科研院所等單位開展了應(yīng)用示范。
圖4 芯片式高通量數(shù)字化核酸分析芯片及儀器
