單細(xì)胞分析是研究細(xì)胞異質(zhì)性的關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)生物學(xué)過程研究及新藥研發(fā)有著重要意義。目前，單細(xì)胞基因組學(xué)技術(shù)較為成熟，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析技術(shù)近年來獲得較多關(guān)注和投入。與其他組學(xué)相比，單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析剛剛起步，面臨諸多技術(shù)難點(diǎn)。由于脂質(zhì)數(shù)量龐大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其在單細(xì)胞層面的結(jié)構(gòu)表征和定量分析頗具挑戰(zhàn)。質(zhì)譜儀因其高靈敏度、高特異性和準(zhǔn)確定量能力，已成為單細(xì)胞脂質(zhì)組分析的主要技術(shù)。然而，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)等代謝物的精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定（如碳碳雙鍵位置和sn-位置）與定量分析仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。
脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常復(fù)雜，根據(jù)頭基的不同，可將脂質(zhì)劃分為不同類型。此外，脂質(zhì)的脂肪酸鏈（fatty acyl chain）、脂肪酸鏈位置（sn-position）、碳碳雙鍵位置（C=C location）、雙鍵幾何構(gòu)型（cis/trans）等結(jié)構(gòu)特征均可變化，造成脂質(zhì)異構(gòu)體數(shù)量繁多。近年來，研究者們開發(fā)了多項(xiàng)技術(shù)，用于脂質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定，包括臭氧誘導(dǎo)解離、環(huán)氧化和光化學(xué)（Paternò-Bǜchi，PB）反應(yīng)等。同時(shí)，多項(xiàng)單細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分析技術(shù)也已報(bào)道，包括探針電噴霧質(zhì)譜、流式電噴霧質(zhì)譜和單探針質(zhì)譜等。然而，由于單細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)物絕對(duì)含量低和結(jié)構(gòu)分析方法缺失等限制，單細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析仍面臨著重大挑戰(zhàn)。
近日，清華大學(xué)精密儀器系馬瀟瀟副教授和歐陽(yáng)證教授帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)，發(fā)展了一種基于質(zhì)譜的新型單細(xì)胞脂質(zhì)組精細(xì)結(jié)構(gòu)分析方法。該技術(shù)利用自由基誘導(dǎo)解離、PB反應(yīng)與多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)sn-位置異構(gòu)體和C=C位置異構(gòu)體的鑒定與相對(duì)定量，解決了哺乳動(dòng)物單細(xì)胞內(nèi)大規(guī)模脂質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)分析這一關(guān)鍵技術(shù)難題。該技術(shù)的基本原理如圖1所示：首先利用戊二醛對(duì)固定細(xì)胞進(jìn)行固定，使細(xì)胞在水溶液保持形態(tài)完整。在電遷移和液滴輔助電噴霧作用下，固定后的單細(xì)胞完成實(shí)現(xiàn)高靈敏度質(zhì)譜檢測(cè)（圖1b）。細(xì)胞固定后，磷脂酰膽堿（PC）的回收率可達(dá)90%以上。采用水溶性2-乙酰吡啶（2-AP）作為反應(yīng)試劑，有效避免了衍生過程中細(xì)胞脂質(zhì)的溶解問題。
圖1. 單細(xì)胞脂質(zhì)組的質(zhì)譜精細(xì)結(jié)構(gòu)技術(shù)（a）單細(xì)胞脂質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)解析流程圖,（b）基于電遷移和液滴輔助電噴霧（DAESI）的單細(xì)胞質(zhì)譜分析，（c）未固定和固定的細(xì)胞提取液內(nèi)前級(jí)離子掃描（PIS）m/z 184掃描質(zhì)譜圖，（d）戊二醛固定下的PC回收率統(tǒng)計(jì)，（e）單細(xì)胞群體獨(dú)立光化學(xué)衍生反應(yīng)裝置圖。
結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜分析，研究人員實(shí)現(xiàn)了對(duì)單細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)C=C位置異構(gòu)體的鑒定和相對(duì)定量分析。以單個(gè)MDA-MB-231中的PC 34:1（m/z 760）為例，其PB產(chǎn)物離子（m/z881）在串級(jí)質(zhì)譜下可以產(chǎn)生三對(duì)診斷離子：636/725，650/739和678/767，分別代表PC 16:0_18:1(Δ8), PC 16:0_18:1(Δ9)和PC 16:0_18:1(Δ11)。進(jìn)而利用這些診斷離子的相對(duì)強(qiáng)度即可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)脂質(zhì)異構(gòu)體的相對(duì)定量分析（圖2a）。除PC外，該技術(shù)還可以用于脂肪酸（FA）、甘油二脂（DAG）、甘油三酯（TAG）、膽固醇酯（CE）等其他脂質(zhì)的分析（圖2b, c）。此外，還實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)sn位置異構(gòu)體的鑒定和相對(duì)定量分析。以人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)的PC 34:1為例，其碳酸氫根加合物經(jīng)多級(jí)質(zhì)譜分析可產(chǎn)生兩個(gè)sn特異性診斷離子，419和445，代表PC 16:0_18:1和PC 18:1_16:0。液滴輔助電噴霧使得單細(xì)胞多次采樣和分析成為可能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該技術(shù)可對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行至少八次采樣，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)脂質(zhì)分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定和相對(duì)定量。
圖2. 單細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析。（a）單個(gè)MDA-MB-231內(nèi)PC 34:1的C=C位置鑒定,（b）單個(gè)MCF-7內(nèi)FA 18:1的C=C位置鑒定，（c）單個(gè)MCF-7內(nèi)DAG 36:2的C=C位置鑒定，（d）單個(gè)MDA-MB-231內(nèi)PC 34:1的sn位置鑒定。
該研究中，隨后開展了對(duì)野生型（HCC827）和耐藥型（HCC827/GR6）非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞的單細(xì)胞精細(xì)脂質(zhì)組學(xué)分析。從脂質(zhì)分子相對(duì)定量、脂質(zhì)sn位置異構(gòu)體相對(duì)定量和脂質(zhì)C=C位置異構(gòu)體相對(duì)定量等層次分別開展研究（圖3.a-d）。t-SNE降維聚類分析表明，僅脂質(zhì)C=C位置異構(gòu)體的相對(duì)定量分析能準(zhǔn)確區(qū)敏感和耐藥肺癌細(xì)胞。該團(tuán)隊(duì)在HCC827中檢測(cè)到了約9%的耐藥細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道的7~12%的結(jié)果高度一致，表明單細(xì)胞精細(xì)脂質(zhì)組學(xué)分析在精準(zhǔn)醫(yī)療方面具有不可替代的重要作用。
圖3. 敏感型和耐藥型NSCLC細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別。（a-c）t-SNE降維聚類圖，（a）由脂質(zhì)分子相對(duì)含量分布計(jì)算而得,（b）由脂質(zhì)sn位置異構(gòu)體相對(duì)含量計(jì)算而得，（c）由脂質(zhì)C=C位置異構(gòu)體相對(duì)含量計(jì)算而得。（d）每種聚類分析中樣品數(shù)目統(tǒng)計(jì)。（e）敏感型與耐藥型細(xì)胞中含有C16:1(Δ9)或C18:1(Δ11)的PC 32:1異構(gòu)體相對(duì)含量比較。***p<0.001。（f）HCC827和HCC827/GR6單細(xì)胞內(nèi)PC 32:1的C=C位置異構(gòu)體相對(duì)含量分布。
最后，以四個(gè)典型單細(xì)胞為例，闡釋了同一細(xì)胞系內(nèi)不同細(xì)胞間的異質(zhì)性，并研究了可用于耐藥NSCLC細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別的潛在生物標(biāo)志物。通過定量分析可以發(fā)現(xiàn)，含有C16:1(Δ9)或C18:1(Δ11)的PC 32:1異構(gòu)體相對(duì)含量在耐藥型NSCLC細(xì)胞內(nèi)含量為41.0±5.1%，在敏感型NSCLC細(xì)胞內(nèi)含量為55.7±4.9%，可用于敏感和耐藥細(xì)胞區(qū)分。例如，在來自HCC827細(xì)胞系的細(xì)胞1,3中，細(xì)胞1屬于敏感型，細(xì)胞3屬于耐藥型；在來自HCC827/GR6細(xì)胞系的細(xì)胞2,4中，細(xì)胞2屬于耐藥型，細(xì)胞4屬于敏感型。以上結(jié)果表明相同細(xì)胞系內(nèi)的單細(xì)胞之間存在顯著異質(zhì)性，為耐藥型和敏感型NSCLC細(xì)胞的區(qū)分提供了關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)癌癥等疾病的精準(zhǔn)診療具有重要意義。
本研究的相關(guān)結(jié)果已發(fā)表于Nature Communications。該論文得到了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目的支持。
